Phản ứng màu Biuret (Biu - rê) là phản ứng dùng để nhận biết sự có mặt của liên kết peptit trong cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ.
Khi có mặt peptit, ion đồng(II) hình thành phức chất màu tím cẩm quỳ trong dung dịch kiềm. Một số biến thể của phép thử này đã được phát hiện, như là phép thử BCA và phép thử Lowry sửa đổi.
Phản ứng màu biure cũng có thể dùng để đánh giá nồng độ của protein, bởi các liên kết peptit xuất hiện với cùng tần suất của axit amin trong peptit. Theo định luật Beer–Lambert, độ đậm của màu tím cũng như khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 540 nm tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
Trái với tên gọi, thuốc thử của phản ứng này không chứa biure (H2N-CO-)2NH. Tên gọi này là do nó cho kết quả dương tính với liên kết peptit như trong phân tử biure.
Trong phản ứng này, đồng(II) liên kết với nitơ có trong peptit của protein, đồng thời bị đẩy xuống đồng(I). Các chất đệm, như Tris và amoni cản trở phản ứng này, khiến nó không phù hợp cho mẫu protein chiết từ kết tủa amoni sunfat. Do tính nhạy kém và ít bị axit amin tự do ảnh hưởng, phương pháp này chủ yếu được dùng cho mẫu mô lớn và những nguồn chứa nhiều protein khác.
Trong thí nghiệm này người ta sử dụng Cu(OH)2 mới sinh trong dung dịch kiềm để tạo phức màu tím. Ngoài ra, có một số biến thể của phản ứng này cũng đã được mở rộng để nhận biết các hợp chất hữu cơ.
Người ta cũng sử dụng phản ứng màu Biuret để định lượng protein bằng cách đo mật độ quang (UV-VIS) của dung dịch phức tạo thành ở bước sóng 540nm sau đó tính toán dựa trên định luận Beer-Lambert.
Mặc dù trong phân tử của protein không có phân tử buiret ((H2N-CO-)2NH) nhưng phép thử vẫn được đặt tên là phản ứng màu Buiret với lý do loại phản ứng này cũng cho phép thử liên kết peptit trong phân tử buiret.
Quy trình test định tính.
Mẫu thử được xử lý bằng cách thêm một lượng dung dịch base mạnh 1% (thường là NaOH hoặc KOH), sau đó được thêm một vài giọt dung dịch CuSO4. Nếu dung dịch chuyển sang màu tím thì chứng minh được sự có mặt của protein (với nồng độ có thể xác định được là khoảng 5-160mg/l).
Trong phép thử BCA, Cu+ tạo thành một phức chất tím đậm sau khi phản ứng với axit bicinchoninic (BCA), hấp thụ bước sóng khoảng 562 nm, tạo thành màu cẩm quỳ đặc trưng. Phức chất BCA/đồng tan được và hấp thụ mạnh hơn nhiều so với phức chất peptit/đồng, làm tăng độ nhạy của phép thử biure lên khoảng 100 lần: phân tích BCA cho phép phát hiện protein trong khoảng nồng độ từ 0,0005 đến 2 mg/mL. Ngoài ra, phương pháp phân tích protein BCA còn tương thích với nhiều chất hơn, như chất hoạt động bề mặt với nồng độ lên đến 5% trong mẫu thử protein.
Trong phương pháp phân tích protein Lowry, Cu+ bị oxi hóa lại thành Cu2+ bởi MoVI (có trong thuốc thử Folin–Ciocalteu, tạo thành molypden xanh dương MoIV. Tyrosine có trong protein cũng tạo thành molypden xanh trong điều kiện này. Phương pháp này có thể phát hiện protein với nồng độ từ 0,005 đến 2 mg/mL. Molypden xanh dương lại có thể liên kết với những chất nhuộm hữu cơ như malachi xanh lục hay Auramine O, càng làm tăng độ nhạy của phản ứng.
Tại Ba Lan, phép thử còn được gọi là phép thử Piotrowski, nhằm vinh danh nhà sinh lý học người Ba Lan Gustaw Piotrowski (sinh năm 1833), mô tả thí nghiệm này lần đầu năm 1857.
Thuốc thử Buiret
Các thuốc thử biuret được làm bằng kali hydroxide (KOH), đồng (II) sulfat ngậm nước cùng với tartrat natri kali. Khi thử, nếu có mặt Protein, thuốc thử chuyển từ màu xanh sang tím. Nếu thuốc thử chuyển từ màu xanh sang màu hồng thì trong dung dịch có sự hiện diện của các chuỗi ngắn polypeptide [?]
Không phải tất cả các xét nghiệm biuret cần dùng thuốc thử biuret. Phương pháp thường được sử dụng trong xét nghiệm định lượng protein là phương pháp đo mật độ quang UV-VIS tại bước sóng 540 nm (để phát hiện các ion Cu2+).
Tăng nhạy cho phép thử Buiret.
Cu+ là một tác nhân làm giảm mạnh tính nhạy của thuốc thử, tuy nhiên nó có thể loại trừ bằng phản ứng với với Mo (VI) trong thuốc thử Folin-Ciocalteu để tạo thành màu xanh molypden. Bằng cách này, các protein có thể được phát hiện ở nồng độ từ 0,005 và 2 mg / mL [3]. Màu xanh Molypden có thể kết hợp với một số thuốc nhuộm hữu cơ (malachite xanh, Auramin O), có tác dụng khuếch đại tín hiệu trong phép đo quang. [4]
Cu+ tạo thành phức màu tím đậm với axit bicinchoninic (BCA) [5], điều này cho phép tăng nhạy của phép thử để có thể phát hiện protein ở nống độ 0,0005 đến 2 mg / mL. Phép thử này thường được gọi với tên thương mại là "phép thử
Pierce" khi nhà sản xuất đưa ra bộ sản phẩm thử này.
Khi có mặt peptit, ion đồng(II) hình thành phức chất màu tím cẩm quỳ trong dung dịch kiềm. Một số biến thể của phép thử này đã được phát hiện, như là phép thử BCA và phép thử Lowry sửa đổi.
Phản ứng màu biure cũng có thể dùng để đánh giá nồng độ của protein, bởi các liên kết peptit xuất hiện với cùng tần suất của axit amin trong peptit. Theo định luật Beer–Lambert, độ đậm của màu tím cũng như khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 540 nm tỉ lệ thuận với nồng độ protein.
Trái với tên gọi, thuốc thử của phản ứng này không chứa biure (H2N-CO-)2NH. Tên gọi này là do nó cho kết quả dương tính với liên kết peptit như trong phân tử biure.
Trong phản ứng này, đồng(II) liên kết với nitơ có trong peptit của protein, đồng thời bị đẩy xuống đồng(I). Các chất đệm, như Tris và amoni cản trở phản ứng này, khiến nó không phù hợp cho mẫu protein chiết từ kết tủa amoni sunfat. Do tính nhạy kém và ít bị axit amin tự do ảnh hưởng, phương pháp này chủ yếu được dùng cho mẫu mô lớn và những nguồn chứa nhiều protein khác.
Trong thí nghiệm này người ta sử dụng Cu(OH)2 mới sinh trong dung dịch kiềm để tạo phức màu tím. Ngoài ra, có một số biến thể của phản ứng này cũng đã được mở rộng để nhận biết các hợp chất hữu cơ.
Người ta cũng sử dụng phản ứng màu Biuret để định lượng protein bằng cách đo mật độ quang (UV-VIS) của dung dịch phức tạo thành ở bước sóng 540nm sau đó tính toán dựa trên định luận Beer-Lambert.
Mặc dù trong phân tử của protein không có phân tử buiret ((H2N-CO-)2NH) nhưng phép thử vẫn được đặt tên là phản ứng màu Buiret với lý do loại phản ứng này cũng cho phép thử liên kết peptit trong phân tử buiret.
Quy trình test định tính.
Mẫu thử được xử lý bằng cách thêm một lượng dung dịch base mạnh 1% (thường là NaOH hoặc KOH), sau đó được thêm một vài giọt dung dịch CuSO4. Nếu dung dịch chuyển sang màu tím thì chứng minh được sự có mặt của protein (với nồng độ có thể xác định được là khoảng 5-160mg/l).
Biến thể độ nhạy cao
Hai biến thể của phép thử biure thường được dùng trong việc phân tích màu hiện đại để phát hiện peptit: phân tích axit bicinchoninic (BCA) và phân tích Lowry. Trong những phương pháp thử nghiệm này, ion Cu+ tạo thành trong phản ứng màu biure tiếp tục tác dụng với chất khác, dẫn đến màu đậm hơn.Trong phép thử BCA, Cu+ tạo thành một phức chất tím đậm sau khi phản ứng với axit bicinchoninic (BCA), hấp thụ bước sóng khoảng 562 nm, tạo thành màu cẩm quỳ đặc trưng. Phức chất BCA/đồng tan được và hấp thụ mạnh hơn nhiều so với phức chất peptit/đồng, làm tăng độ nhạy của phép thử biure lên khoảng 100 lần: phân tích BCA cho phép phát hiện protein trong khoảng nồng độ từ 0,0005 đến 2 mg/mL. Ngoài ra, phương pháp phân tích protein BCA còn tương thích với nhiều chất hơn, như chất hoạt động bề mặt với nồng độ lên đến 5% trong mẫu thử protein.
Trong phương pháp phân tích protein Lowry, Cu+ bị oxi hóa lại thành Cu2+ bởi MoVI (có trong thuốc thử Folin–Ciocalteu, tạo thành molypden xanh dương MoIV. Tyrosine có trong protein cũng tạo thành molypden xanh trong điều kiện này. Phương pháp này có thể phát hiện protein với nồng độ từ 0,005 đến 2 mg/mL. Molypden xanh dương lại có thể liên kết với những chất nhuộm hữu cơ như malachi xanh lục hay Auramine O, càng làm tăng độ nhạy của phản ứng.
Tại Ba Lan, phép thử còn được gọi là phép thử Piotrowski, nhằm vinh danh nhà sinh lý học người Ba Lan Gustaw Piotrowski (sinh năm 1833), mô tả thí nghiệm này lần đầu năm 1857.
Thuốc thử Buiret
Các thuốc thử biuret được làm bằng kali hydroxide (KOH), đồng (II) sulfat ngậm nước cùng với tartrat natri kali. Khi thử, nếu có mặt Protein, thuốc thử chuyển từ màu xanh sang tím. Nếu thuốc thử chuyển từ màu xanh sang màu hồng thì trong dung dịch có sự hiện diện của các chuỗi ngắn polypeptide [?]
Không phải tất cả các xét nghiệm biuret cần dùng thuốc thử biuret. Phương pháp thường được sử dụng trong xét nghiệm định lượng protein là phương pháp đo mật độ quang UV-VIS tại bước sóng 540 nm (để phát hiện các ion Cu2+).
Tăng nhạy cho phép thử Buiret.
Cu+ là một tác nhân làm giảm mạnh tính nhạy của thuốc thử, tuy nhiên nó có thể loại trừ bằng phản ứng với với Mo (VI) trong thuốc thử Folin-Ciocalteu để tạo thành màu xanh molypden. Bằng cách này, các protein có thể được phát hiện ở nồng độ từ 0,005 và 2 mg / mL [3]. Màu xanh Molypden có thể kết hợp với một số thuốc nhuộm hữu cơ (malachite xanh, Auramin O), có tác dụng khuếch đại tín hiệu trong phép đo quang. [4]
Cu+ tạo thành phức màu tím đậm với axit bicinchoninic (BCA) [5], điều này cho phép tăng nhạy của phép thử để có thể phát hiện protein ở nống độ 0,0005 đến 2 mg / mL. Phép thử này thường được gọi với tên thương mại là "phép thử
Pierce" khi nhà sản xuất đưa ra bộ sản phẩm thử này.
